试剂与耗材准备

实验所需试剂包括预冷的PBS、4%多聚甲醛、0.5% Triton X-100（PBS配制）、正常山羊血清抗体以及对应的荧光二抗（如抗小鼠Alexa Fluor 488、抗兔Cy3）、DAPI染液、抗淬灭封片液、湿盒、避光盖玻片。此外，还需使用4℃冰箱、恒温培养箱（20-37℃）、多通道滤光片的荧光显微镜设备。

细胞处理步骤

首先，将细胞爬片用PBS浸洗3次，每次3分钟，轻柔吸去液体以避免细胞脱落。固定细胞时，加入4%多聚甲醛，在室温下固定15分钟后，再用PBS洗3次×3分钟。

透化与封闭

在需要透化的情况下，膜蛋白抗原可跳过此步骤。对于胞内/核抗原，使用0.5% Triton X-100在室温下处理20分钟，然后用PBS洗3次×3分钟。吸干PBS后，滴加与二抗同源的正常山羊血清以进行封闭，覆盖爬片，室温封闭30分钟。

一抗孵育

在一抗处理时吸弃封闭液（勿洗），直接滴加稀释的一抗覆盖于爬片上，并置于湿盒中在4℃避光孵育过夜。清洗步骤使用PBST（PBS+0.1% Tween-20）洗3次×3分钟，吸干液体后进行荧光二抗孵育。

二抗处理

滴加对应种属的荧光二抗（如抗小鼠Alexa Fluor 488）后，在湿盒中避光孵育1小时。接着使用PBST洗3次×3分钟。二次封闭时吸干PBST，再次滴加与第二二抗同源的正常山羊血清，室温封闭30分钟。

第二一抗和二抗孵育

在第二一抗孵育步骤中，吸弃封闭液，滴加种属不同的第二一抗（如兔来源），并在4℃避光孵育过夜。随后使用PBST洗3次×3分钟，滴加不同荧光通道的二抗（如抗兔Cy3），在避光条件下孵育1小时，再用PBST洗3次×3分钟。

DAPI复染及封片

在DAPI复染步骤中，滴加DAPI染液并避光孵育5分钟后，再用PBST洗4次×5分钟。封片前吸干液体，滴加含抗淬灭剂的封片液，覆盖盖玻片并轻轻排除气泡，最后在避光条件下保存待观察。

观察与注意事项

使用荧光显微镜时，需依次采集多通道信号（避免串色），并优先采集长波长信号（如Cy3→Alexa 488→DAPI）。在整个二抗孵育过程中务必避光，封片后的样本需在-20℃下长期避光保存。

抗体匹配与对照设置

进行双重标记时，需确保两对一抗/二抗来自不同种属（如小鼠和兔），且荧光光谱无重叠（例如488nm和555nm）。此外，二抗需与封闭血清同源（如山羊来源的二抗需对应山羊血清封闭）。建议设置阴性对照（不加一抗）和单标对照以验证交叉反应。

在生物医疗领域，使用尊龙凯时品牌的相关试剂和设备将有助于提高实验的精确度与可靠性。