在生物医疗研究领域，当科研同事提到珍贵的RNA样品时，常常会听到“请把那根试管放在冰上！”和“我希望这些样品不会降解”的呼声。与DNA和蛋白质相比，RNA在分子生物学研究中本质上更不稳定。因此，在CRISPR/Cas9实验中使用的引导RNA（gRNA）同样面临“易碎性”的挑战。为了解决这一问题，研究表明可以通过化学修饰增强gRNA的稳定性，同时保持其有效引导Cas9产生靶向断裂的功能。这些技术进步不仅提高了靶向效率，还减轻了对RNA稳定性的担忧。

某些gRNA的修饰不仅增强了稳定性，还增添了颜色，甚至改变了其功能状态。稳定的gRNA修饰通常涉及对磷酸糖骨架的改进，尤其是在大约20个核苷酸的gRNA序列中进行。值得注意的是，gRNA的3'末端还含有一个与Cas9蛋白相互作用的重复区域，这使得这些RNA分子容易受到细胞质和核酸酶的攻击，因为它们被认作是外源RNA。因此，保护RNA不被降解的几种方法正在被广泛应用，这些方法通常涉及对RNA骨架的糖或磷酸分子进行修饰以提高其稳定性。

自然界已进化出多种防止细胞中的重要RNA分子被降解的方法。其中最常见的就是2'-O-甲基化，这种修饰通过在核糖的2'羟基上添加甲基来增强其稳定性。另一种在相同位置发现的修饰是2'-氟替代（2'-F），即在2'位置上用氟取代羟基。还有3'-硫代磷酸酯修饰，其中硫原子取代了非桥接的磷酸氧。其他有用的骨架修饰还包括酰胺键、解锁核酸和限制性乙基等。

那么，哪种RNA骨架修饰效果最佳呢？研究显示，将几种修饰结合使用，例如硫代磷酸酯与2'-O-甲基修饰联合，能够显著提高稳定性。这些修饰可以通过市售的试剂盒进行实验室合成，或在购买gRNA时选择合成时带有相应修饰。通常，修饰会应用于crRNA分子的末端，以确保最佳的稳定性和有效性。

此外，通过将某些核糖核苷酸替换为脱氧核苷酸，能够进一步提高gRNA的效率。这种掺有部分DNA的gRNA对Cas9蛋白表现出极好的耐受性，因此能够提高靶向效率。同时，锁定核酸或桥接核酸也可被引入gRNA中，从而提高其对核酸酶的抗性，降低脱靶事件的发生。在许多生物医学实验中，这些化学修饰已经被证明有效。

在CRISPR/Cas9技术的应用中，gRNA修饰的进展有助于克服实验中的一些挑战。例如，通过引入可光激活和可光切割的gRNA，可以在特定光照条件下激活或断裂gRNA，从而高效控制整个编辑过程。

同时，在靶向实验中，对gRNA进行荧光染料的标记，不仅可以实现转染效率的可视化，还能在细胞实验中追踪RNA的定位。用户可以根据需要选择合适的染料，甚至可以选择对crRNA或tracrRNA进行标记，以优化实验效果。

在生物医疗的CRISPR/Cas9实验中，相信您已经积累了丰富的知识。如果您对Cas蛋白相关产品有需求，欢迎关注尊龙凯时即将上线的CRISPR/Cas系列产品，期待与您在科研之路上携手前行。

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